高效基因编辑新突破：我国科学家首次利用内源I-B型CRISPR/Cas系统改造“生物农药工厂”

【导语】近日，上海师范大学生命科学学院芦银华研究员团队在《中国科学：生命科学》英文版发表了一项突破性研究成果。他们首次在非模式工业放线菌——刺糖多孢菌中，成功建立了一种基于内源I-B型CRISPR/Cas系统的高效基因组编辑工具。这一创新技术不仅解决了刺糖多孢菌长期面临的遗传操作难题，还为其他难以改造的工业微生物提供了新的研究思路。刺糖多孢菌是生产绿色生物农药多杀菌素的重要菌株，该研究成果有望推动多杀菌素的高效生产和工业应用。

近日，上海师范大学生命科学学院芦银华研究员团队在《中国科学：生命科学》英文版发表重要研究成果，首次在非模式工业放线菌中建立了一种基于内源I-B型CRISPR/Cas系统的高效基因组编辑工具，解决了工业放线菌刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）长期面临的遗传操作难题，也为其他难以改造的工业微生物(wù)提(tí)供(gōng)了(le)新(xīn)思(sī)路。

刺(cì)糖(táng)多(duō)孢(bāo)菌(jūn)是(shì)生(shēng)产(chǎn)绿(lǜ)色(sè)生(shēng)物(wù)农(nóng)药(yào)多(duō)杀(shā)菌(jūn)素(sù)的(de)重(zhòng)要(yào)工(gōng)业(yè)菌(jūn)株(zhū)。多(duō)杀(shā)菌(jūn)素(sù)具(jù)有(yǒu)高(gāo)效(xiào)、广(guǎng)谱(pǔ)的(de)杀(shā)虫(chóng)活(huó)性(xìng)，且(qiě)哺(bǔ)乳(rǔ)动(dòng)物(wù)细(xì)胞(bāo)毒(dú)性(xìng)低(dī)、安(ān)全性(xìng)高(gāo)，是(shì)一(yī)种“环境友好型”杀虫剂。然而，刺糖多孢菌转化效率低、遗传工具匮乏，导致其代谢工程改造困难重重，产能瓶颈难以解决。依赖外源CRISPR/Cas9系统的基因组编辑技术虽然已在诸多物种取得突破，但针对工业微生物，依然面临转化效率低、宿主毒性强等问题，难以广泛应用。研究团队另辟蹊径，巧用细菌“原生剪刀”——内源I-B型CRISPR/Cas系统，通过生物信息学分析和实验验证，确定了该系统识别的PAM序列（基因切割的“定位信号”）（图1）。通过重编程靶向自身基因组的微型CRISPR阵列，建立新型编辑工具，成功实现高效的基因敲除。该方法无需导入外源Cas蛋白，编辑质粒更小、毒(dú)性(xìng)更(gèng)低(dī)。

图1. 刺糖多孢菌内源Type I-B型CRISPR/Cas系统。

（A）刺糖多孢菌内源CRISPR/Cas系统组成及转录分析。（B）I-B型CRISPR/Cas系统组成的Cascade复合体在crRNA引导下靶向DNA示意图。Cascade复合体由Cas11、Cas8、Cas7、Cas6、Cas5等蛋白组成。在PAM被Cas8识别后，Cascade结合到目标DNA上，招募Cas3在原间隔区内切割目标DNA的非靶向链。（C）WebLogo显示的介导CRISRP/Cas系统DNA切割功能的可能PAM序列。

另外，刺糖多孢菌具有多种RM防御系统，如同“分子守卫”般切割外来DNA，导致质粒转化效率极低。研究团队利用新开发的基因敲除工具，逐一敲除关键RM系统，得到一株转化效率显著提高的工程菌株，这为后续的遗传操作扫清了障碍。在此基础上，实现了荧光报告基因mCherry的高效插入，以及长达75 kb的多杀菌素生物合成基因簇的成功敲除（图2）。这些结果显示该工具针对单基因以及基因簇强大的编辑能力，为刺糖多孢菌高产育种提供了必要的技术支撑。

图(tú)2. 基(jī)于(yú)内(nèi)源(yuán)CRISPR系(xì)统(tǒng)的(de)高(gāo)效(xiào)基(jī)因(yīn)组(zǔ)编(biān)辑(ji)技(jì)术(shù)应(yīng)用于外源基因插入及刺糖多孢菌基因簇大片段敲除。

（A）构建敲除质粒，实现对目标基因簇敲除示意图。（B）基因簇敲除菌落PCR鉴定，上图为基因簇外侧引物PCR验证，下图为利用基因簇内部引物PCR验证(zhèng)。（C）基(jī)因(yīn)簇(cù)敲(qiāo)除(chú)菌(jūn)株(zhū)的(de)Sanger测(cè)序(xù)验(yàn)证(zhèng)。（D）mCherry插(chā)入(rù)刺(cì)糖(táng)多(duō)孢(bāo)菌(jūn)基(jī)因(yīn)组(zǔ)示(shì)意(yì)图(tú)。mCherry插(chā)入(rù)菌(jūn)落(luò)PCR鉴(jiàn)定(dìng)（E）及(jí)测(cè)序(xù)验(yàn)证(zhèng)（F）。